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GV3101 Electroporation-Competent Cell LM81001AE

Stbl4感受态细胞

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GV3101 Electroporation-Competent Cell 

基因型

C58 (rifR) Ti pMP90 (pTiC58DT-DNA) ( gentR) Nopaline

产品说明

GV3101菌株为C58型背景,核基因中含有筛选标签——利福平抗性基因rif,为了便于转化操作,此菌株携带一无自身转运功能的胭脂碱型Ti质粒pMP90 (pTiC58DT-DNA),此质粒含有vir基因 (vir基因是T-DNA插入植物基因组必需的元件,pMP90 (pTiC58DT-DNA)质粒自身的T-DNA转移功能被破坏,但可以帮助转入的双元载体T-DNA顺利转移)。pMP90 (pTiC58DT-DNA)型Ti 质粒含有筛选标签:gent,赋予GV3101菌株庆大霉素抗性,适用于拟南芥、烟草、玉米、土豆等植物的转基因操作。唯地生物开发的GV3101电转感受态特别适用于大质粒的转化:经pCAMBIA2301质粒 (size:11633 bp)检测转化效率>10cfu/μg DNA;经pCAMBIA2301-ZH质粒 (size:40 kb)检测转化效率可达5×10cfu/μg DNA。

操作方法

1. 0.1 cm电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上5分钟,待其沥干水分,正置5分钟,使乙醇充分挥发,待乙醇挥发干净立即插入冰中,压实冰面,电极杯顶离冰面0.5 cm以方便盖上杯盖,冰中静置5分钟充分降温。

2. 取-80℃保存的农杆菌感受态插入冰中5分钟,待其融化,加入0.01-1 μg质粒DNA(体积不大于6ul,感受态转化效率较高,第一次使用前最好做预实验确定所加质粒的量),用手拨打管底混匀,立即插入冰中,用200 μl枪头将感受态-质粒混合物快速移到电击杯中,盖上杯盖,空管保留待用。

3. 启动电转仪,设置参数:C=25 μF,PC=200 ohm,V=2400 V(此参数为Biorad 推荐,使用者也可按所用电转仪推荐的protocol操作),将电击杯快速放入电转槽中,电击完成快速插入冰中,加入700 μl无抗生素的LB并转移到感受态空管中,28℃振荡培养2~3小时。

4. 6000 rpm离心一分钟收菌,留取100 μl左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含相应抗生素的LB或YEB平板上,倒置放于28℃培养箱培养2-3天

(当平板只含有50 μg/ml kan 时,28℃培养48 h即可;平板中同时加入50 μg/ml kan,20 μg/ml rif 时,需28℃培养60 h;如果使用的平板含有50 μg/ml rif 则需要28℃培养72-90 h)。

备注

1、农杆菌相关抗生素配方:

抗生素

配方

原液

工作液

羧苄青霉素(carb)

双蒸水溶解,0.22 μm滤膜过滤除菌

50 mg/ml

50 μg/ml

硫酸卡那霉素(kan)

双蒸水溶解,0.22 μm滤膜过滤除菌

50 mg/ml

50 μg/ml

链霉素(strep)

双蒸水溶解,0.22 μm滤膜过滤除菌

10 mg/ml

50 μg/ml

利福平(rif)

DMSO溶解,0.22 μm滤膜过滤除菌

10 mg/ml

20 μg/ml

庆大霉素(gent)

双蒸水溶解,0.22 μm滤膜过滤除菌

20 mg/ml

40 μg/ml

 

2、常用农杆菌抗性:(R:抗;S:敏感。)

农杆菌菌株

羧苄青霉素(carb)

链霉素(strep)

利福平(rif)

庆大霉素(gent)

硫酸卡那霉素(kan)

AGL-1

R

S

R

S

S

EHA101

S

S

R

S

R

EHA105

S

S

R

S

S

LBA4404

S

R

R

S

S

GV3101

S

S

R

R

S

 

3LBYEB配方:

component

LB(液体)/L

LB(固体)/L

component

YEB(液体)/L

YEB(固体)/L

Tryptone

10 g

10 g

Tryptone

5 g

5 g

Yeast extract

5 g

5 g

Yeast extract

1 g

1 g

NaCl

10 g

10 g

牛肉浸膏

5 g

5 g

NaOH 

调PH到7.0

调PH到7.0

蔗糖

5 g

5 g

Agar

15 g

MgSO4*7H2O

0.49 g

0.49 g




NaOH 

调PH到7.0

调PH到7.0




Agar

15 g

注意事项

1. 加入质粒时体积不应大于感受态体积的1/10;质粒不纯或存在乙醇等有机物污染,转化效率急剧下降;质粒增大一倍,转化效率下降一个数量级。

2. 混入质粒时应轻柔操作。转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。

3. 平板上阳性克隆密度过大时,由于营养不足,阳性克隆生长变慢,菌落变小,为了获得大的菌落,应减少质粒用量。

4. 利福平浓度不应高于25 μg/ml,过高的利福平浓度不利于农杆菌生长,会降低其生长速度和转化效率。本公司感受态计算转化效率时所用平板只含有50 μg/ml kan,若所用平板含有20 μg/ml rif则转化效率降低到1/2。

5. 培养基中加入利福平的目的是防止杂菌生长、筛选农杆菌;根据所用菌株抗性加入Ti质粒筛选抗生素可防止Ti质粒丢失,但Ti质粒筛选抗生素不利于农杆菌的转基因操作,所以一般培养农杆菌时不考虑这些抗生素,Ti质粒丢失的概率极低(可以忽略)。 

保存条件(保质期):-80℃(6个月)

本产品只适用于科研,不能用于临床诊断。严禁用于临床医疗及其他非科研用途!

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