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Y190感受态细胞 LM8307CC

Y190感受态细胞

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Y190感受态细胞

产品储存:-80 ℃保存,6 个月有效。

产品组成:

基因型: 

MATa, ura3-52, his3-200, ade2-101, lys2-801, trp1-901, leu2-3, 112, gal4Δ, gal80Δ, cyhr2, LYS2 : :GAL1UAS-HIS3TATA-HIS3, MEL1 URA3 : : GAL1UAS-GAL1TATA-lacZ

产品说明: 

Y190 菌株是 GAL4 系统酵母双杂实验用菌株,MATa 型,可直接转化质粒或与 MATα型酵母菌株 Y187通过 mating 操作进行蛋白互作验证或筛库试验。Transformation marker 为:trp1,leu2,cyh2;报告基因为:lacZ,HIS3,MEL1。Y190-GAL4 酵母双杂系统需要两种质粒配套使用:(pGB 和 pACT2)或(pGBKT7 和pGADT7)。质粒 pGB 由 pGBKT7 改造而来,筛选标志为 TRP1,用于表达 DNA-BD(来自酵母转录因子GAL4N 端 1~174 位氨基酸)与目标蛋白(Bait)的融合蛋白;质粒 pACT2 与 pGADT7 的结构和功能类似,筛选标志为 LEU,用于表达 AD(GAL4 C 端 768~881 位氨基酸)与目标蛋白(Prey)的融合蛋白。 GAL4系统原理:一个完整的酵母转录因子 GAL4 可分为功能上相互独立的两个结构域:位于 N 端 1~174 位氨基酸区段的 DNA 结合域(DNA-BD)和位于 C 端 768~881 位氨基酸区段的转录激活域(AD)。DNA-BD 能够识别 GAL4-responsive gene 的上游激活序列 UAS,并与之结合。而 AD 可以启动 UAS 下游的基因进行转录。

BD 和 AD 单独存在不能激活转录,但当二者接近时,则呈现完整的 GAL4 活性,使含有 UAS 的启动子下游基因转录表达。正常条件下,BD 不与 AD 结合,将要检测的蛋白质分别与 BD 和 AD 融合,形成 bait融合蛋白(bait –BD)和 prey 融合蛋白(prey-AD),如果 bait 和 prey 发生相互作用,就会促使 BD 和 AD 的相互接近,形成完整的 GAL4,从而激活报告基因的转录。Y190 感受态细胞经特殊工艺制作,-80 ℃可保存六个月,pGADT7 质粒检测转化效率>104 cfu/μg DNA。

使用方法:

1. 取 Y190 感受态细胞 100 µL 于冰上融化的,依次加入预冷的目的质粒 2-5 µg,Carrier DNA (95-100 ℃,5 min,快速冰浴,重复一次) 10 µL,PEG/LiAc 500 µL 并吸打几次混匀,30 ℃水浴 30 min (15 min 时翻转6-8 次混匀)。

2. 将管放 42 ℃水浴 15 min (7.5 min 时翻转 6-8 次混匀)。

3. 5000 rpm 离心 40 s 弃上清,ddH2O 400 µL 重悬,离心 30 s 弃上清。

4. ddH2O 50 µL 重悬,涂板,29 ℃培养 48-96 h。

注意事项:

1. 感受态细胞最好在冰上融化。

2. 转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。

3. 同时转化 2-3 种质粒时可增加质粒的用量。

4. Y190 酵母菌株对高温敏感,最适生长温度为 27-30 ℃;高于 31 ℃,生长速度和转化效率呈指数下降。

5. 菌落变粉不是污染,是酵母细胞生长中一个常见现象。当细胞在平板培养几天后,平板上的 Adenine 被酵母消耗完毕,酵母试图通过自身代谢途径合成 Adenine 以供利用,然而,有些菌株的 ADE2 基因被破坏,Adenine 合成途径受阻;又由于其 ADE4,5,6,7,8 基因均正常,所以造成中间产物 P-ribosylamino imidazole(AIR)在细胞中积累而使菌落变为粉红色。

6. 酵母在缺陷培养基中生长速度比 YPDA 培养基慢,培养基中缺陷成分越多,生长越慢,以转化涂板为例:涂 YPDA 平板 29 ℃,48 h 培养可见直径 1 mm 克隆;涂 SD 单缺平板 29℃,48-60 h 培养可见直径 1mm 克隆,涂 SD 双缺平板 29℃,60-80 h 培养可见直径 1 mm 克隆,涂 SD 三缺或四缺平板平板 29 ℃,80-90 h 培养可见直径 1 mm 克隆。

本产品只适用于科研,不能用于临床诊断。严禁用于临床医疗及其他非科研用途!

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