LBA4404感受态细胞
储存条件:-80 ℃(12 个月)
产品规格:100 μL/支
基因型:Ach5 (rifR) Ti pAL4404 (strepR) Octopine
产品说明:
LBA4404 菌株为 Ach5 型背景,核基因中含有筛选标签----利福平抗性基因 rif,为了便于转化操作,此菌株携带一无自身转运功能的章鱼碱型 Ti 质粒 pAL4404,此质粒含有 vir 基因(vir 基因是 T-DNA 插入植物基因组必需的元件,pAL4404 质粒自身的 T-DNA 转移功能被破坏,但可以帮助转入的双元载体 T-DNA顺利转移)。pAL4404 型 Ti 质粒含有筛选标签:strep,赋予 LBA4404 菌株链霉素抗性,适用于菸草、番茄、烟草等植物的转基因操作。
使用方法:
1. 取-80℃保存的农杆菌感受态于室温或手心片刻待其部分融化,处于冰水混合状态时插入冰中。
2. 每 100 μL 感受态加入 0.01-1 μg 质粒 DNA(转化效率较高,第一次使用前最好做预实验确定所加质粒的量),用手拨打管底混匀,依次于冰上静置 5 min、液氮 5 min、37℃水浴 5 min、冰浴 5 min。
3. 加入 700 μL 无抗生素的 LB 或 YEB 液体培养基,于 28℃振荡培养 2~3 h。
4. 6000 rpm 离心 1 min 收菌,留取 100 μL 左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含相应抗生素的 LB 或 YEB平板上,倒置放于 28℃培养箱培养 2-3 天。
注意事项:
1. 加入质粒时体积不应大于感受态体积的 1/10;质粒不纯或存在乙醇等有机物污染,转化效率急剧下降;质粒增大一倍,转化效率下降一个数量级。
2. 混入质粒时应轻柔操作。转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
3. 平板上阳性克隆密度过大时,由于营养不足,阳性克隆生长变慢,菌落变小,为了获得大的菌落,应减少质粒用量。
4. 利福平浓度不应高于 25 μg/mL,过高的利福平浓度不利于农杆菌生长,会降低其生长速度和转化效率。
感受态计算转化效率时所用平板只含有 50 μg/mL kan,若所用平板含有 20 μg/mL rif 则转化效率降低到 1/2。
5. 培养基中加入利福平的目的是防止杂菌生长、筛选农杆菌;根据所用菌株抗性加入链霉素或庆大霉素可防止 Ti 质粒丢失,但链霉素不利于农杆菌的转基因操作,培养农杆菌时不考虑链霉素或庆大霉素,Ti 质粒丢失的概率极低(可以忽略)。
6. 不适用于氨苄青霉素抗性质粒。
本产品只适用于科研,不能用于临床诊断。严禁用于临床医疗及其他非科研用途!