His标签蛋白纯化试剂盒I型（超声裂解）

保存温度：按产品成分说明保存，有效期一年。

产品内容：

注意：I 型为超声裂解法，II(型为酶解法。均适用于可溶性和包涵体中 His 标签蛋白的纯化。

产品说明：

1. 本试剂盒是基于 His-Ni 亲和层析的蛋白质纯化方法进行 His 标签蛋白纯化的试剂盒；

2. 变性和非变性条件均可使用，也适用于纯化包涵体中的 His 标记蛋白。

3. 最大载量为 20-30 mg His 标记蛋白质/mL 介质。

4. 本试剂盒可用于 10 次 His 蛋白纯化（50mL 体积的细菌)。

操作步骤：

一：裂解

1. 将 Ni-Agarose 介质充分混匀后，取适量加入到预放了一片筛板的层析柱中。

注意：介质用量需要根据 His 蛋白产量决定，其最大载量为 20-30 mg His 标记蛋白质/mL 介质，请根据实验需要取适量的 Ni-Agarose 介质加入层析柱。

2. 用 5 倍柱体积（指填料的体积，下同）自备去离子水洗柱，共三次。

3. 用 5 倍柱体积的洗涤液洗柱，共三次。

4. 室温 5000 g 离心 10 min 收集 50 mL 表达菌液，弃上清，沉淀放冰上待用或放-80℃保存。最好用不加诱导物的菌液做对照样。

注意：以下成分均以 50mL 菌液计算用量，实际用量可根据菌体量增减。

5. (1)超声破碎细菌：加入 2.5 mL 冰浴的超声裂解缓冲液，再加入 60 uL PMSF（10 mg/mL）溶液，冰上超声裂解菌体直到在显微镜下看见绝大多数细胞破裂。超声参数需根据仪器型号自行摸索，但裂解

物必须不粘稠，否则会堵塞层析柱。

(2)酶法裂解细菌：加入 2.5 mL 冰浴的酶解液，再加入 60 uL PMSF（10 mg/mL）溶液，震荡混匀，冰上放置 30 分钟。

6. 4℃下 13000-15000 g 离心 10 min，去除残留细胞和细胞碎片以防堵柱，收集上清，留样做 SDS-PAGE电泳对照。可溶的 His 蛋白在上清液中，包涵体的 His 蛋白在沉淀中。

二：纯化

A：纯化细胞裂解液中可溶部分的 His 标记蛋白

1. 将上步得到的上清液上柱，用层析柱的底端的盖子盖上，让细菌裂解液和介质在 4℃结合 30 min-12h后取掉盖子让重力使裂解液自然流出。

2. 用 10 倍柱体积洗涤液洗柱，收集并保存穿透液（含杂质或没被吸附的 His 标记蛋白，可做 SDS-PAGE电泳的对照）。

3. 按下表配置含不同浓度咪唑的洗脱液，以确定 His 标签蛋白的最适洗涤液的咪唑浓度。按从低到高的顺序洗涤并收集样品，SDS-PAGE 电泳检测 His 标记蛋白所在的区域。

4. 如已知咪唑洗脱浓度，可直接配置该浓度的洗脱液进行洗涤。

5. 洗脱后，依次使用 10 倍柱体积的去离子水洗涤柱子，再用 3 倍柱体积的 20%乙醇平衡（乙醇要将填料浸没），最后堵住层析柱下端的漏口，4℃保存待下次使用。

B：纯化包涵体中 His 标记蛋白

1. 将上步(一-6)得到的得到的包涵体沉淀重悬于 2 mL 包涵体变性洗涤液。冰浴 1 h 以使包涵体溶解，期间可轻柔摇晃几次。

2. 室温 10，000 g 离心 20 min ，沉淀为未溶解的包涵体。将上清（含溶解后的 His 标记蛋白）以自备的针头过滤器（0.45 um）过滤。

3. 将滤过液上柱，用层析柱底端的盖子盖上，让细菌裂解液和介质在 4℃结合 30 min-12h 后取掉盖子让重力使裂解液自然流出。

4. 用 10 倍柱体积包涵体变性洗涤液洗柱，收集并保存穿透液（含杂质或没被吸附的 His 标记蛋白，可做 SDS-PAGE 电泳的对照）。

5. 按下表配置含不同浓度咪唑的变性洗脱液，以确定 His 标签蛋白的最适洗涤液的咪唑浓度。按从低到高的顺序洗涤并收集样品，SDS-PAGE 电泳检测 His 标记蛋白所在的区域。

C：纯化已复性的包涵体蛋白

1：将可溶性蛋白溶液，按照 A：纯化细胞裂解液中可溶部分的 His 标记蛋白操作。

本产品只适用于科研，不能用于临床诊断。严禁用于临床医疗及其他非科研用途！