动物总蛋白提取试剂盒(变性)
保存:4℃保存,一年有效,蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂-20℃保存。
包装内容:
产品简介:
本产品含有多种细胞裂解成分和蛋白酶抑制成分,适用于培养细胞(包括悬浮细胞)和新鲜组织。可以在非变性或变性条件下迅速裂解组织或培养细胞,使之释放出细胞内蛋白,用于后续实验。
动物总蛋白提取液(非变性)能最大程度地保留蛋白天然结构和功能,主要用于免疫沉淀和免疫共沉淀,还可以用于蛋白活性检测(信号传递研究和酶动力学检测)和 Western Blot 等各种后续实验。
动物总蛋白提取液(变性)裂解细胞的效率更高,主要用于对抗原空间构型不敏感的免疫共沉淀实验,还可以用于 Western Blotting。
注意事项:
1. 在裂解液中选择性加入 1/100 的蛋白酶抑制剂/磷酸酶抑制剂/PMSF 溶液。
2. 整个裂解步骤都要在冰浴或 4℃操作。本产品和 PBS 均需预先冷却。
3. 本产品所含有较高浓度的去垢剂会对 Bradford 蛋白浓度测定有较大影响,因此只能使用 BCA 法测定蛋白浓度。
使用方法:
一:处理贴壁的培养细胞
1. 去除贴壁细胞培养液,用冰浴预冷的 PBS 洗两遍,去尽残留的 PBS。
2. 将培养板放置在冰上待用。
3. 按每 106 个细胞加入 0.1 mL 本产品(或 100mm 贴壁细胞加 1mL 提取液)的比例向培养板中加入适量的本产品(按此比例裂解得到的裂解物的蛋白浓度约在 5-10 mg/mL 之间)。
注意:裂解效率跟细胞数量和本产品用量的比例密切相关。一般情况下 6 孔板的单孔(1~2×106 细胞)需要 0.1~0.2 mL 本产品;25 cm2 培养瓶(3~6×106 细胞)需要 0.3~0.6 mL;75 cm2 培养瓶(1~2×107 细胞)需要 1~2 mL。对于特别大或特别小的细胞,需要用户摸索最佳用量。
1. 冰上放置 10-30 分钟(最佳时间跟细胞系相关),其间偶尔轻轻摇晃或用枪头轻轻吹打。
2. 将细胞培养板倾斜使上清液汇集在一端,并将其全部转移到一个新的 1.5mL 塑料离心管中。
3. 15,000×g,4℃离心 10 分钟,将上清转移到一个新的 1.5 mL 塑料离心管中,放置在冰上待用或放-80℃长期保存。注意:如果用于免疫沉淀,最好新鲜使用。
4. 使用前最好先测定上清液的蛋白浓度,然后再进行后续的电泳、Western 或免疫沉淀操作。
二:处理悬浮细胞
1. 400g,4℃离心 10 分钟收集悬浮细胞,弃上清。
2. 用等体积的预冷 PBS 洗涤细胞沉淀两遍,步骤同第一步。
3. 按每 106 个细胞加入 0.1 mL 本产品的比例加入提取液,充分悬浮细胞。
4. 冰上放置 15 分钟裂解细胞,期间偶尔轻柔震荡。
5. 15,000×g,4℃离心 10 分钟,将上清转移到一个新的 1.5 mL 塑料离心管中。为避免吸取到细胞沉淀,最好留 20-40uL 液体不取。
6. 将上清液放置在冰上待用或放-80℃长期保存。注意:如果用于免疫沉淀,最好新鲜使用。
7. 使用前最好先测定上清液的蛋白浓度,然后再进行后续的电泳、Western 或免疫沉淀操作。
三:处理组织块
1. 称量组织块,用毛玻片或玻璃匀浆器研磨或匀浆,用 5-10 倍体积的、预冷的 PBS 洗两次(包括冲洗器材)。
2. 将匀浆物转移到离心管中,1500g、4℃离心 5 分钟后弃上清。
3. 按每 50 mg 组织加入 0.2 mL 提取液的比例加入预冷的提取液,吹打混匀,放置冰上。
4. 每隔 5 分钟振荡器轻柔振荡一次,共 4 次。
5. 15,000×g、4℃离心 10 分钟,将上清转移到一个新的 1.5 mL 塑料离心管中,放置在冰上待用或放-80℃长期保存。注意:如果用于免疫沉淀,最好新鲜使用。
6. 使用前最好先测定上清液的蛋白浓度,然后再进行后续的电泳、Western 或免疫沉淀操作。
本产品只适用于科研,不能用于临床诊断。严禁用于临床医疗及其他非科研用途!