包涵体蛋白溶解及复性试剂盒

保存：RT 保存，保质期 1 年

包装内容：

产品说明：

本产品用 E.coli 作为宿主表达得到的重组蛋白往往会形成包涵体，其中的重组蛋白质只完成部分折叠，还没形成最后的正确空间结构，所以没有生物活性，要得到有活性的重组蛋白，还需要后续的溶解和复性（重折叠）处理。

采用温和法溶解包涵体，释放的包涵体蛋白质不彻底变性，还能保持其部分折叠的结构，使后续的复性处理效率提高。

本试剂盒足够 100 次小规模（1mL 规模）的蛋白质复性实验。

操作步骤：

一：洗涤包涵体

说明：用常规方法得到的包涵体常常含有去污剂和细胞碎片，因此需要经过充分的洗涤才能用于本实验。

1. 将 10mg 包涵体沉淀溶解在 5mL 包涵体洗涤液中，超声波处理 8-10 次或充分吹打混匀。可以适当留取 10-30uL 作为 SDS-PAGE 电泳样品待用。

2. 4℃ 12000 rpm 离心 20 分钟后弃上清。

3. 重复上面的洗涤步骤 3 次，每次留取 10-30uL 作为 SDS-PAGE 电泳样品待用。

4. 将包涵体沉淀溶解在 1 mL 包涵体洗涤液中，超声波处理 8 -10 次或充分吹打混匀。

5. 检查包涵体的纯度：将上步得到的包涵体溶液和前几步得到的预留样品一起用于 SDS-PAGE 电泳，检查每次洗涤去除杂带的情况。

6. 检查包涵体的浓度：用自备的 BCA 蛋白检测试剂盒测试第 4 步得到的包涵体溶液的蛋白质浓度。

7. 将第 4 步得到的包涵体溶液的蛋白质浓度调到 5-10 mg/mL(如果低于此范围围，则离心后用适量的洗涤液再溶解；如果高于此范围，则用洗涤液稀释)，然后均分到 10 个 1.5 mL 塑料离心管中，每管 100 uL。

8. 4℃ 12000 rpm 离心 20 分钟后弃上清。

9. 所得沉淀即纯化的待用的包涵体。

二：确定溶解包涵体的最佳条件

1. 标记上步得到的 10 个离心管，并分别加入 10 种包涵体温和溶解液，每种 1mL。注意：准确记录它们的对应关系。

2. 充分振荡后，室温放置 30 分钟。

3. 450 nm 检测浑浊度并记录下数据。

4. 4℃ 12000 rpm 离心 10 分钟后收集上清，此即包涵体溶解液。

5. 用 0.22 um 注射器式滤膜过滤包涵体溶解液。

6. 280 nm 检测包涵体溶解液的光吸收。

7. 溶解液溶解包涵体能力跟包涵体溶液浊度跟成反比，跟包涵体溶解液中OD280 数值成正比。根据上面的数据即可确定哪种溶解液对实验中所用包涵体具有最佳溶解能力，并将在此溶解液中溶解的包涵体溶解液用于下面的复性实验。大量处理需要从本公司单独大量订购包涵体温和型溶解液 10 种中的 1 种。

三：包涵体蛋白的复性

1. 在 2.5 mL 4℃预冷的、处于轻柔搅拌中的复性缓冲液中，逐滴加入上步得到的包涵体溶解液。

2. 待所有包涵体溶解液都加完后，将包涵体蛋白复性溶液用孔径为 0.22 um注射器式滤膜过滤，除去包涵体（直径一般在 0.5-0.8 um）和大的聚合物。

3. 将得到的溶液用于活性检测或离子交换柱层析和分子筛层析。

本产品只适用于科研，不能用于临床诊断。严禁用于临床医疗及其他非科研用途！