LightSpeed DNA Assembly Mix Plus

产品简介：

  基于重组原理的无缝克隆技术，作为新一代的克隆方法，不依赖繁琐的酶切、连接步骤，也不需要末端补平等操作，依据 DNA 片段与线性化载体末端的 15~25 nt 同源序列的重组，可将插入片段克隆至任意线性载体的任意位点，载体自连背景极低，是一种简单、快速、高效的 DNA 定向克隆技术。

  LightSpeed DNA Assembly Mix Plus 无缝克隆试剂盒，一次反应可完成单至多个 DNA 片段的重组，最快仅需 5 分钟即可完成单片段重组，且阳性率高于 95%。Mix 中添加的辅助因子，有效提高克隆阳性率；经优化的反应体系，能够一定程度上耐受未纯化 PCR 产物中含有的杂质。升级版的无缝克隆试剂盒具有更高的阳性率、更好的兼容性。

产品组成：

使用方法：

1. 实验流程概要

2. 线性化克隆载体制备

选择合适的克隆位点，对载体进行线性化，载体的线性化可以通过酶切或反向 PCR 扩增完成。

1 酶切制备 

推荐使用 LightSpeed 快速内切酶进行双酶切，使载体线性化完全，以降低转化背景（假阳性克隆）；若使用单酶切进行线性化，可以适当延长酶切时间以减少环状质粒残留。 

注 1：经双酶切进行线性化的载体无需去磷酸化，经单酶切则需要去磷酸化； 

注 2：酶切完成后，应将快速内切酶失活或对目的产物纯化后再用于重组反应。 

2 反向 PCR 扩增制备 

为减少扩增突变的引入，推荐使用高保真 PCR Mix 进行扩增。推荐使用预线性化质粒作为模板，以减少环状质粒模板残留对克隆阳性率的影响。

3. 插入片段 PCR 引物设计

PCR 引物的 5'端必须包含与其相邻片段（插入片段或载体）末端同源的 15~25 nt（推荐 18 nt）序列。假如载体为粘性末端，且 3'端突出，则引物设计必须包含突出部分；若 5'端突出，则引物设计可以包含突出部分，也可以不包含。

插入片段正向扩增引物：

5'—上游载体末端同源序列+酶切位点（可选）+基因特异性正向扩增序列—3'

插入片段反向扩增引物：

3'—基因特异性反向扩增序列+酶切位点（可选）+下游载体末端同源序列—5'

注 1：尽量选择无重复序列且 GC 含量均匀的区域进行克隆，当载体克隆位点上下游 25 nt 区域内 GC 含量为 40%~60%时，重组效率最高；

注 2：本试剂盒所提供的 pUC19 载体（Ampr）连接端序列如下：

4. 插入片段的 PCR 扩增

推荐使用高保真 PCR Mix 进行扩增，以减少扩增突变的引入。建议使用纯化后的 PCR 产物进行无缝克隆反应，若 PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定为特异性扩增产物，可直接使用，但加样体积不应超过总反应体积的 20%。

5. 重组反应

①于冰水浴中配置以下反应体系：

注 1：若插入单片段的长度大于载体，则应互换载体与插入片段用量；

注 2：若插入片段的长度小于 200 bp，则插入片段应使用 5 倍载体用量；

注 3：若按上述公式计算得到的用量超过最低/最高值，则建议直接按最低/最高用量使用；

注 4：载体片段过长、插入片段过长或片段数过多，克隆阳性率均会降低。

a. 最适载体用量（ng）=0.02×载体碱基对数，即 0.03 pmol。

b. 插入单片段，最适片段用量（ng）=0.04×片段碱基对数；插入多片段，每片段最适用量（ng）=0.02×片段碱基对数。

重组反应体系配制完成后，用移液枪轻轻吸打混匀各组分，避免产生气泡，切勿涡旋。

②将反应体系置于 50℃，反应 5~60 分钟。

注 1：推荐使用 PCR 仪等温控比较精准的仪器进行反应，反应时间不足或太长克隆效率均会降低；

注 2：插入 1~2 个片段时，推荐反应时间为 5~15 分钟；插入 3~5 个片段时，推荐反应时间为 15~30 分钟；

注 3：当载体骨架在 10 kb 以上或插入片段在 4 kb 以上时，建议延长反应时间到 30~60 分钟；

注 4：50℃反应完成后，建议进行瞬时离心，将反应液收集至管底。 

③将反应液离心管置于冰上冷却，之后进行转化或者储存于-20℃。

注 1：-20℃储存的重组产物，建议在 1 周内使用；

6. 重组产物转化

取 5~10μl 反应液，加入到 100 μL 感受态细胞中，缓慢吸打混匀，冰上放置 30 分钟。42℃热激 45~60 秒，冰浴 5 分钟。加 500 μL SOC 或 LB 培养基，37℃振荡培养 40~60 分钟（200 rpm）。将菌液均匀涂布在含有对应抗生素的平板上，倒置于 37℃过夜培养。

注 1：不同感受态细胞最后的克隆阳性率会有所差别，推荐使用转化效率>108 CFU/μg 的感受态细胞；

注 2：菌落数取决于 PCR 产物与线性化载体的数量和纯度；

注 3：阳性对照平板通常生长大量白色单菌落，阴性对照平板只生长很少的菌落

7. 阳性克隆检测

挑取单菌落至 10 μL ddH2O 中混匀，95℃裂解 10 分钟后，取 1 μL 裂解液作为模板，进行菌落 PCR 鉴定，或将单菌落接种至抗性培养基中培养过夜后，提取质粒进行酶切鉴定。

阳性对照的阳性克隆检测，菌落 PCR 引物使用通用引物 M13F 与 M13R，酶切鉴定用 HindIII 与 EcoRI。

注 1：菌落 PCR 时建议至少使用一条通用引物，避免假阳性结果；

注 2：必要时可进一步对阳性结果进行测序鉴定。

注 3：M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT

M13R：CAGGAAACAGCTATGAC

本产品只适用于科研，不能用于临床诊断。严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

以实际收货产品说明书为准，网站说明书仅供参考。