活细胞/死细胞染色试剂盒（Calcein-AM/PI 双染法）

各组成储存条件：有效期一年。

● 41260A     -20℃避光保存；

● 41260B 和 41260C 2-8℃保存。

● 注意：长期不用可以-20℃保存。● 染色液 Calcein AM 注意防潮；避免反复冻融。

● 41260A 为 DMSO 溶液，冬季气温较低时在是温室时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热溶解，吸头也需要放在培养箱预热，否则容易再次凝固在吸头内壁产生耗 损。溶解后离心至管底部再打开螺旋盖。

● 41260B 溶解后需要用吸头打混匀。

● 试剂拆封后请尽快使用。

注意事项：

 本试剂盒仅供科学研究使用，不可用于诊断或治疗。

产品简介：

活细胞/死细胞染色试剂盒是采用 Calcein-AM/PI 双染细胞的方法染色活细胞和死细胞。Calcein-AM 是一种可对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂，Calcein-AM 由于在 Calcein 的基础上加强了疏水性，因此能够轻易穿透活细胞膜。当其进入到细胞质后，酯酶会将其水 解为 Calcein 留在细胞内， 发出强绿色荧光。与其他同类试剂（ 如 BCECF-AM 和Carboxy-fluorescein diacetate）相比， Calcein-AM 是最适合最为荧光探针去染活细胞的，因为他的细胞毒性很低。Calcein 的激发和发射波长分别为 490nm 和 515|nm。Calcein-AM 仅对活细胞染色。作为核染色染料的 PI 不能穿过活细胞的细胞膜，它穿过死细胞膜的无序区域而到达细胞核， 并嵌入细胞的 DNA  双螺旋从而产生红色荧光（激发：488，545nm，发射：617nm）， 因此PI 仅对死细胞染色。 

由于 Calcein-AM 和 PI-DNA 都可被 490nm 激发，因此可用荧光显微镜同时观察活细胞和死细胞。用 545nm 激发，仅可观察到死细胞。根据以上特点，Calcein，AM 和 PI 经常被结合用来作为活细胞和死细胞的双重染色。

试剂盒以外制备试剂和仪器：

●流式细胞仪/荧光显微镜/激光共聚焦

●离心机

●移液器

●冰箱

●冰盒

●吸头

●离心管

● 一次性手套

●    PBS 缓冲液（ ph7.4, 实验室常用 10mM 磷酸缓冲盐溶液（ 1X))(phosphate buffer saline/Dulbecco’s PBS :约含 8mM NA2HPO4、2mMKH2PO4、137mM NaCI 和 3mM KCI)

● HBSS (Hank's balanced salt solution；with：calcium magnesium glucose；without：phenol red。components CaCI2(anhydrous )140mg/L(1.261mM) 、 MgCI2-6H2O 100mg/mL(0.493mM) 、MgSO4-7H2O 100mg/L (0.407mM)、KCI 400mg/L (5.333mM)、KH2PO4 60mg/L (0.441mM)、NaHCO3 350mg/L (4.167mM) 、 NaCI 8000mg/L (137.93mM) 、 Na2HPO4(anhydrous)48mg/L (0.338mM)、D-Glucose 1000mg/L(5.556mM)。

使用注意事项：

● 螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂前心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开 盖时液体洒落。

●  染色液 A 为 DMSO 溶液，冬季气温较低时在室温时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热溶解，吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损 耗。融解后离心至管底部再打开螺旋盖。

●   试剂 A 为了便于观察防止误操作导致损失，在试剂盒中时是采用透明管包装，收到后可以离心移入干燥黑色避光密封管或者用铝箔包裹避光。

●   细胞处理需要小心操作，尽量避免人为的损伤细胞。

●   由于 Calcein-AM 对湿度非常敏感，若是 Calcein-AM 溶液每次取完需要量后，必须紧紧密封盖子。建议根据单次用量，分装密请封保存。不可使用含水的吸头。

●   试剂 A 母液请拧紧螺旋盖，避免受潮失效。

●   可以使用以下方法来优化得到两种荧光染料的最佳工作浓度。1）用 0.1% 皂素或者0.1-0.5%地高辛孵育细胞 10min，或者用 70%乙醇孵育细胞 30min,从而制备死细胞；2）用15000 倍-1500 倍稀释（试剂盒中的母液）的 PI 溶液进行死细胞染色，以得到不仅仅对细胞核染色，而不会对细胞质染色的最佳工作浓度。3）用 1000 倍-100 倍稀释（试剂盒中的母液）的 Calcein-AM 进行死细胞染色，以得到不会对细胞质染色的最佳工作浓度。然后用此浓度进行活细胞染色，去观察是否活细胞能被染色。

1.    染色工作液的配制：

根据样品数按下列比列配制染色工作液。

用染料稀释液试剂 C 将染色液 A 和 B 分别 10 倍稀释。

每 10ml HBSS 缓冲液或无血清培养基中加入 100ul 稀释过的染色液 A，充分混匀，即成染色工作液 A.

每 10ml HBSS 缓冲液或无血清培养基中加入 5-50ul 稀释过的染色液 B,充分混匀， 即成染色工作液 B.

【注】：

●   由于不同细胞系的最佳染色条件不同，初次实验建议做梯度实验。以确定 Calcein-AM 和PI 的最适浓度。梯度筛选的原则为使用最低的探针浓度得到最好的荧光结果。Calcein-AM 染色时间一般 15-30 分钟，PI 染色时间一般 1-5 分钟。

● 一般细胞 Calcein-AM 染色终浓度为试剂盒中母液的 1000 倍稀释即可，个别细胞可能需要提高浓度至 500 倍稀释或者延长染色时间。PI 的使用终浓度为试剂盒中母液的 5000-3000 倍稀释，常用 10000-20000 倍。

● Calcein-AM 溶液和 PI 溶液可以分开染色，先用 Calcein-AM 染色，再用 PI 染色，也可以混合在一起同时染色。最好分开染色。

● 如果 Calcein-AM 溶液和 PI 溶液同时染色时，可以将 Calcein-AM 溶液和 PI 溶液根据预实验的浓度同时加入无血清培养基或 HBSS 缓冲液中，配成一种染色工作液。注意 PI 的浓度在染上色的前提尽可能低，否则可能有细胞毒性，使原本的活细胞染色。

● 可以不用本试剂盒的染料稀释，直接用 HBSS、无血清培养基配成染色工作液。不可以用含血清培养基配制。

● Calcein-AM 染色工作液必须现配现用，并且在当天用完。

2. 收集样本细胞。

【注】

● 根据下游检测仪器和应用需要，贴壁细胞时，可以先用胰酶-EDTA   等消化细胞，制备成细胞悬液。也可以直接原位染色检测

3. 用 PBS 洗涤细胞两次。

【注】

● 由于培养基中的血清等含有酯酶，导致 Calcein-AM 遇水会分解，会导致空白上升，所以需要用 PBS 洗涤数次直到完全洗净。

● 贴壁细胞可以原位染色，注意吸除培养基前培养板离心机离心，防止丢掉漂浮的死细胞。

 PBS 洗涤时也需要离心培养板。

4. 用 200ul 染色工作液细胞重悬。

【注】

● 有时候可添加一定量的非离子表面活性剂如 Pluroin F127 到 Calcein AM 来增强其水溶性。制备染色工作液前，取一管需要用 Calcein AM 内加入 20%Pluroin F127，使 Pluroin F127 的最终浓度为 0.02%。

● 含 Pluroin F127 到 Calcein AM 溶液不可长期保存，现配现用。

5. 在室温或 37℃避光孵育 15-20 分钟。

【注】

● 如果分开染色，Calcein AM 染色 15-30 分钟，PI 染色 1-5 分钟。

● 同时染色时，一定要注意 PI 浓度，防止染色活细胞。

● 如果细胞本身含有有机阴离子转运体，需加入丙磺舒（probencid,1-2.5mM)或者苯磺唑酮

（sulfinpyrazone,0.1-0.25mM)到孵育体系内以降低染料 Calcein  泄露到胞外。

6. 用 PBS 洗涤细胞。

【注】 

● 如有必要，使用含有阴离子转运抑制剂的缓冲液来进行细胞清洗。

7. 用适量 PBS 重悬细胞。

8. 用荧光显微镜或流式细胞仪检测结果。最大激发为 490nm,最大发射波长为 515nm 和617nm.

● 在荧光显微镜下观察时，如果背景高，可以用培养基再次清洗掉细胞外的染料后再观察。 

结果分析：

荧光显微镜下，使用 488nm  波长激发，活细胞为黄绿色，死细胞为黄色。用波长 545nm 波长激发，仅能够看到细胞的死细胞。