KM71H感受态细胞(化转)
产品储存:-80 ℃保存
产品组成:
产品说明:
KM71H 是毕赤酵母菌株,属于真核细胞。一般的针对原核生物的抗生素例如卡那和氨苄对酵母是无效的,因此为了防止大肠杆菌等原核生物对酵母培养菌株污染,往往会在培养基中加入一些氨苄和卡那霉素的抗生素,来抑制细菌菌的污染和生长。毕赤酵母适宜的生长温度是 28 至 30℃,温度超过 32℃对蛋白的表达是有害的,并可能导致细胞的死亡。KM71H 毕赤酵母被推荐用来表达含有 Zeocin 抗性的载体载体重组质粒,例如 pPICZ A,B,C 系列的载体。在筛选 KM71H 重组转化菌株时,Zeocin 抗生素的工作浓度是100 ug/ml。
KM71H 宿主菌中的 AOX1 基因含有一个片段缺失,当 pPICZ A,B,C 或者 pPICZα A,B,C 转化到 KM71H中时只能产生出 MutS 转化株,不必在进行 Mut 基因型的筛选了。KM71H 的来源母细胞在精氨琥珀酸裂解酶基因(arg4)含有一个突变,这使得菌株无法在不含有精氨酸的培养基中生长。而 KM71H 酵母细胞中在AOX1 基因处插入了一个正常的 arg4 基因,从而形成了 KM71H 的 MutS, Arg+表型。将约 2kb 的 Arg4 基因克隆出来后插入到 KM71H 来源菌株内的野生型的 AOX1 基因的 BamH I(16 bp)和 Sal I(227 bp)中间,从而构建成功 KM71H。ARG4 基因直接替换了 AOX1 基因的 16-227 片段序列。KM71H 毕赤酵母细胞的优点是不需要利用甲醇 minimal media 筛选菌株的 Mut 基因型,因为所有的转化株都是 MutS 菌株。另外,AOX1 基因并没有被完全删除,理论上你可以用自己的基因替换其中的 Arg4 基因,从而生成 MutS, Arg-的转化株,但是由于实验表明该基因型酵母菌株在含有精氨酸的 minimal media 上并不能很好的生长,所以并不鼓励大家进行这种基因替换尝试。
使用方法:
1. 取 0.1-5 μg 质粒 DNA(线性化质粒加入量 5-50 μg)和 10 μL 预变性 Carrier DNA,加入到未融化的 100-200μL 感受态细胞上,置于 30 ℃水浴,每隔 15 S 颠倒混匀,直至感受态细胞刚好完全融化(融化后及时取出)。
2. 加入 1.4 mL B2 溶液颠倒混匀。30 ℃水浴 60 min,每隔 20 min 颠倒混匀
3. 3,000 rpm 离心 3 min 弃上清留菌体沉淀,加入 1 mL B3 溶液重悬菌体。
4. 3,000 rpm 离心 3 min 弃上清留菌体沉淀,加入 100 μL B3 溶液重悬菌体。
5. 将 100 μL 菌液全部涂布到相应的平板培养基,30 ℃恒温培养 3-5 天,直至平板出现酵母克隆。
注意事项:
1. 初次使用 Carrier DNA,请把装有 Carrier DNA 的管子在沸水中煮沸 5 min,然后立即放在冰上,用后放在-20 ℃储存备用。下次使用前请于冰上解冻 Carrier DNA。反复冻融 3-5 次后需重新变性 Carrier DNA。
2. 转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
3. 同时转化 2-3 种质粒时可增加质粒的用量。
4. 毕赤酵母适宜的生长温度是 28 至 30℃,温度超过 32℃对蛋白的表达是有害的,并可能导致细胞的死亡。
本产品只适用于科研,不能用于临床诊断。严禁用于临床医疗及其他非科研用途!